五、PCR 引物设计（包括杂交探针设计）
（一）引物设计的原则
1.引物要跟模板紧密结合；
2.引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在；
3.引物不能在别的非目的位点引起高效DNA聚合反应(即错配)。
（二）引物设计需要考虑的因素
?引物长度（primer length），
?产物长度（product length），
?序列Tm值 (melting temperature)，
?ΔG值(internal stability)，
?引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin），
?错误引发位点（false priming site），
?引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。
（三）引物设计要点
?一般引物的长度为16-23bp，常用的长度为18-21bp，过长或过短都不合适。
?引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。
?引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
?引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右，当然由于模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据具体情况灵活运用。
?ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标。
?一般情况下，在Oligo 5.0软件的ΔG值窗口中，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间部分ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。
?其原理，引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的整合，因此5’端与中间段的ΔG值应较高，而3’端ΔG值影响DNA聚合酶对模板DNA的解链，过高则不利于这一步骤。
?可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，最好没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的产物的假带。
?引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带，且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行。
?对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。